Минаев Михаил Юрьевич — кандидат технических наук, руководитель направления молекулярно-биологических исследований, ведущий научный сотрудник, лаборатория «Гигиена производства и микробиология»
109316 г. Москва, ул. Талалихина 26, Тел.: +7–495–676–60–11
Mikhail Yu. Minaev — candidate of sciences, a head of the Molecular diagnostic division, leading researcher of the Laboratory «Hygiene of production and microbiology»
109316, Moscow, Talalikhina str., 26 Tel.: +7–495–676–60–11
Махова Анжелика Александровна — младший научный сотрудник, лаборатория «Гигиена производства и микробиология»
109316 г. Москва, ул. Талалихина 26, Тел.: +7–495–676–60–11
Anzhelika A. Makhova — junior researcher of the Laboratory «Hygiene of production and microbiology»
109316, Moscow, Talalikhina str., 26 Tel.: +7–495–676–60–11
One of the methods to evaluate the level of gene expression is a real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Interest in the study of molecular mechanisms of gene expression and its evaluation in prokaryotes is due to the lack of research on this issue and a number of methodological problems. The paper presents a study of gene expression mechanism in prokaryotes evidence from Aeromonas salmonicida AS1 gyrase B and collagenase genes. As a result of the research, Random primer and oligo (dT) primer (two 3’-terminal nucleotides of the primer complementary to stop codon nucleotides of the transcribed DNA sequence) with anchor and adapter of our own design were tested, which are used in the reaction of reverse transcription. The use of oligo (dT) primer became possible only after polyadenylation of extracted RNA using special poly-A polymerase kit. It is determined that the developed protocol of reverse transcription (RT) using oligo (dT) primer and adapter with certain sequence on its 5’-terminus designed for further annealing of the reverse primer during real-time PCR along with preliminary polyadenylation of RNA excludes specific amplification of the background genomic DNA. This technique may be applied in evaluating the expression level of low-expression genes when high background genomic DNA content is found in the RNA sample, e.g. at the end of logarithmic growth of prokaryotic cells.
Contribution
All authors bear responsibility for the work and presented data. All authors made an equal contribution to the work. Minaev M. Yu. developed scientific and methodological approaches to work, determined the scope of research, analyzed the data obtained, performed the narrative and corrected it in final. Makhova A.A. selected research objects, carried out RNA extraction, reverse transcription and PCR analysis, performed the narrative part. The authors were equally involved in writing the manuscript and bear the equal responsibility for plagiarism.
Conflict of interest
The authors declare no conflict of interest.
Количественная полимеразная цепная реакция (qПЦР) в реальном времени — один из методов оценки уровня экспрессии генов. Интерес к изучению молекулярных механизмов экспрессии генов и ее оценки в прокариотической клетке обусловлен недостатком исследований по данному вопросу и рядом методологических проблем. В работе представлено изучение механизма экспрессии генов у прокариот на примере генов гиразы Б и коллагеназы Aeromonas salmonicida AS1. В результате проведенных исследований были протестированы применяемые в реакции обратной транскрипции случайный (Random) и праймер oligo (dT) с «якорем» (два крайних нуклеотида праймера по 3` концу, комплементарные нуклеотидам стоп-кодона транскрибируемой последовательности ДНК) и адаптером собственной разработки. Применение oligo (dT) праймера стало возможным только после полиаденирования выделенной РНК с помощью специального набора с поли — А полимеразой. Установлено, что разработанный нами протокол проведения обратной транскрипции (ОТ) с использованием oligo (dT) праймера и определенной последовательностью адаптера на его 5` конце, предназначенного для дальнейшего отжига реверс-праймера при проведении ПЦР в реальном времени наряду с предварительным полиаденилированием РНК исключает специфическую амплификацию остаточной фоновой геномной ДНК. Данная методика может найти применение в оценке уровня экспрессии низкоэкспрессионных генов при высоком содержании примеси фоновой геномной ДНК в образце РНК, например, на конечной стадии логарифмического роста прокариотической клетки.
Критерии авторства
Ответственность за работу и предоставленные сведения несут все авторы. Все авторы в равной степени участвовали в этой работе. Минаев М.Ю. разрабатывал научно-методический подход к проведению работ, определял объем исследований, анализировал полученные данные, выполнял описательную часть и корректировала финальную версию статьи. Махова А.А. отбирала объекты исследования, проводила выделение РНК, обратную транскрипцию, постановки ПЦР, выполняла описательную часть. Авторы в равных долях имеют отношение к написанию рукописи и одинаково несут ответственность за плагиат.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.