meatTheory and practice of meat processingТеория и практика переработки мяса2414-438X2414-441XФГБНУ «Федеральный научный центр пищевых систем им. В.М. Горбатова» РАН10.21323/2414-438X-2017-2-4-4-19meat-75Research ArticleСтатьиAN INFLUENCE OF SPONTANEOUS MICROFLORA OF FERMENTED HORSEMEAT PRODUCTS ON THE FORMATION OF BIOLOGICALLY ACTIVE PEPTIDESВЛИЯНИЕ СПОНТАННОЙ МИКРОФЛОРЫ ФЕРМЕНТИРОВАННЫХ МЯСНЫХ ПРОДУКТОВ ИЗ КОНИНЫ НА ОБРАЗОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ПЕПТИДОВЧернухаИ. М.ChernukhaI. M.

Чернуха Ирина Михайловна — доктор технических наук, профессор, член-корреспондент РАН, Руководитель научного направления центра.

109316, Москва, ул. Талалихина,26, тел.: раб. +7–495–676–97–18

Irina M. Chernukha — doctor of technical sciences, professor, corresponding members of RAS, Head of the scientific direction of the center.

109316, Moscow, Talalikhina str., 26, Tel.: +7–495–676–97–18

imcher@inbox.ruНиконовИ. Н.NikonovI. N.

Никонов Илья Николаевич — заместитель директора по науке и развитию.

Il’ya N. Nikonov  — deputy director for research and development.

196650, St. Petersburg, Kolpino, Izhorsky factory, 45, lit. ДВ, теl.: +7–812–322–85–50

nikonov@biotrof.ruМашенцеваН. Г.MashentsevaN. G.

Машенцева Наталья Геннадьевна — доктор технических наук, профессор РАН, заведующий кафедрой «Биотехнология и технология продуктов биоорганического синтеза».

125080, Москва, Волоколамское шоссе, 11, тел.: +7–499–811–00–03, доб. 6883

Natal’ya G. Mashentseva  — doctor of technical sciences, professor RAS,, head of the Department of Biotechnology and Technology of Products of Bioorganic Synthesis.

125080, Moscow, Volokolamskoe sh., 11, tel.: +7–499–811–00–03, ext. 6883

natali-mng@yandex.ruКлабуковаД. Л.KlabukovaD. L.

Клабукова Дарья Леонидовна — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела технологий и препаратов на основе культур клеток.

127299, Москва, ул. Клары Цеткин, д.4, тел.: +7–495–459–06–64

Daria L. Klabukova  — candidat of biological sciences, senior re‑ search scientist of Department of technologies and products based on cell cultures OJS.

127299, Moscow, Clary Tcetkin str., 4, tel.: +7–495–459–06–64

daria.klabukova@yandex.ruАфанасьевД. А.AfanasevD. A.

Афанасьев Дмитрий Александрович — студент, Институт инновационных технологий и биоиндустрии продуктов питания.

125080 г. Москва, Волоколамское шоссе, 11, Тел.: +7–985–456–77–82

Dmitrii A. Afanasev — student, Institute of Innovative Technologies and Bioindustry of Food Products.

125080, Moscow, Volokolamskoe sh., 11, tel.: +7–985–456–77–82

dmitr.afanasjew2010@yandex.ruКовалевЛ. И.KovalyovL. I.

Ковалев Леонид Иванович — доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биомедицинских исследований.

119071, Москва, Ленинский проспект, д.33, стр. 2, тел.: раб. +7–495–952–58–86

Leonid I. Kovalyov — doctor of biological sciences, leading research scientist of the biomedical research laboratory.

119071, Moscow, Leninsky prospekt, 33 bldg. 2, Phone: +7–495–952–58–86

kovalyov@inbi.ras.ruИльинаЛ. А.IlinaL. А.

Ильина Лариса Александровна — кандидат биологических наук, начальник лаборатории.

196650, С.‑Петербург, Колпино, Ижорский Завод, д. 45, литера ДВ, тел.: +7–812–322–85–50

Larisa A. Ilina — candidat of biological sciences, head of laboratory.

196650, St. Petersburg, Kolpino, Izhorsky factory, 45, lit. DV, теl.: +7–812–322–85–50

ilina@biotrof.ruФедеральный научный центр пищевых систем им. В.М. Горбатова РАНРоссияV.M. Gorbatov Federal Research Center for Food Systems of Russian Academy of SciencesRussian FederationOOO «БИОТРОФ»Россия«BIOTROPH» LimitedRussian FederationМосковский государственный университет пищевых производствРоссияMoscow state university of food productionRussian FederationИнститут прикладной биохимии и машиностроения «Биохиммаш»РоссияInstitute of Applied Biochemistry and Mechanical Engineering «Biochimmash»Russian FederationФедеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наукРоссияFederal Research Centre «Fundamentals of Biotechnology» of the Russian Academy of SciencesRussian Federation20170401201824419Copyright © Chernukha I.M., Nikonov I.N., Mashentseva N.G., Klabukova D.L., Afanasev D.A., Kovalyov L.I., Ilina L.А., 20182018Чернуха И.М., Никонов И.Н., Машенцева Н.Г., Клабукова Д.Л., Афанасьев Д.А., Ковалев Л.И., Ильина Л.А.Chernukha I.M., Nikonov I.N., Mashentseva N.G., Klabukova D.L., Afanasev D.A., Kovalyov L.I., Ilina L.А.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.meatjournal.ru/jour/article/view/75

At present, different methods are used to accumulate functional peptides in meat raw materials, including the use of spontaneous microflora during autolysis, the use of the microbial enzymes (the application of starter cultures) and the use of the non-microbial enzymes (enzymes of animals and plant origin). Each method has its own specific characteristics of an impact on raw materials, which requires their detail study. This paper examines an effect of spontaneous microflora of fermented meat products from horsemeat on formation of biologically active peptides. Using the T-RFLP analysis, it was established that in air dried and uncooked smoked sausages produced with the use of the muscle tissue of horsemeat as a raw material, a significant proportion of microflora was presented by lactic acid microorganisms. The highest content of lactic acid microflora was observed in sample 1 (52.45 %), and the least in sample 3 (29.62 %). Sample 2 had the medium percent content of microflora compared to samples 1 and 3 — 38.82 %. It is necessary to note that about 25 % of microflora was unculturable; i.e., it had metabolic processes but did not grow on culture media. In the samples, the representatives of Actinobacteria and Pseudomonadales were found. Pathogenic and conditionally pathogenic microflora was not detected. Not only quantitative but also qualitative changes were observed in the studied samples. For example, in samples 1 and 2, the fractions of amilo-1,6-glucosidase, fast-type muscle myosin-binding-protein C; glucose-6-phosphate isomerase; fast skeletal muscle troponin I, phosphoglycerate kinase, pyruvate kinase and skeletal muscle actin were found, which were absent or reduced in sample 3. Therefore, in the studied product, good preservation of the main spectra of muscle proteins was observed, and the identified fractions, apparently, can be sources of new functional peptides. Not only quantitative but also qualitative changes were observed in the studied samples. For example, in samples 1 and 2, the C-terminal fragments of the myosin heavy chain were found, which were absent in sample 3. Also, the significant content of myoglobin was revealed in samples 2 and 3, and the myosin light chain was found in sample 1. Therefore, in the studied product, good preservation of muscle proteins myosin and myoglobin, which can be a source of new functional peptides, was observed. Based on the results of tandem mass-spectrometry, the proteins and natural short peptides present in the analyzed extracts were identified by the obtained masses. They belonged mainly to different peptides of equine myoglobin. Also, we identified several fragments, among which fast skeletal muscle troponin T and muscle creatine kinase were found. The obtained materials can be regarded as an experimental basis for the directed impact of starter cultures with a possibility to predict the protein and peptide composition of a finished product including with the aim of obtaining biologically active peptides.

В настоящее время для накопления в мясном сырье функциональных пептидов используют различные методы, в том числе включающие использование спонтанной микрофлоры в ходе автолиза, использование ферментов микробного происхождения (применение стартовых культур) и использование ферментов немикробного происхождения (ферменты животного и растительного происхождения).  Каждый из методов имеет свои специфические особенности воздействия на сырье, что требует их детального изучения. В данной статье рассматривается влияние спонтанной микрофлоры ферментированных мясных продуктов из конины на образование биологически активных пептидов. С использованием T-RFLP-анализа установлено, что в составе микрофлоры сыровяленой и сырокопченой колбас, произведенных с использованием мышечной ткани конины в виде мясного сырья, значительная часть микрофлоры представлена молочнокислыми микроорганизмами. Так, наибольшее содержание молочнокислой микрофлоры наблюдается в образце № 1 (52,45 %), а наименьшее — в образце № 3 (29,62 %). В образце № 2 наблюдается среднее процентное содержание микрофлоры по сравнению с образцами № 1 и № 3 — 38,82 %. Следует также отметить, что приблизительно 25 % микрофлоры относится к некультивируемой, т.е. имеющей метаболические процессы, но не дающей роста на питательных средах. В образцах обнаружены представители актиномицетов и псевдомонад. Патогенной и условно-патогенной микрофлоры не обнаружено. Сравнительное протеомное исследование методом электрофореза трех видов колбас из конины, выработанных с использованием стартовых культур по различным технологиям, показало количественные и качественные различия по нескольким белковым фракциям. Наибольшее отличие в количестве белковых полос наблюдается между образцами № 1/№ 2 и № 3. Белковый профиль конины в образце № 3 имел значительное количественное отличие от белковых профилей образцов № 1 и № 2. Так, количественное содержание белковых полос в образце № 3 в диапазоне молекулярных масс 45–250 кДа всего 4, в то время как в образцах № 1 и № 2 их вдвое больше. В исследуемых образцах наблюдаются не только количественные, но и качественные изменения. Так, в образце № 1 и № 2 обнаружены фракции амило-1,6-глюкозидазы, миозин связывающего белка С быстрого типа,  глюкозо-6-фосфат изомеразы, тропонина I быстрых скелетных мышц, фосфоглицераткиназы, пируваткиназы и скелетномышечного актина, отсутствующие или уменьшающиеся в образце №3. Таким образом, в исследуемой продукции наблюдалась  сохранность основного спектра мышечных белков, а идентифицированные фракции очевидно, могут быть источниками новых функциональных пептидов. По результатам тандемной масс-спектрометрии по полученным массам были идентифицированы природные короткие пептиды, которые присутствовали в анализируемых экстрактах. В основном все они относились к разным пептидам конского миоглобина.  Также было идентифицировано несколько фрагментов, среди которых обнаруживались тропонин-Т скелетномышечный быстрого типа и мышечная креатинкиназа. Полученные материалы можно рассматривать как экспериментальную основу для направленного воздействия стартовых культур с возможностью прогнозирования белкового и пептидного состава готового продукта, в т.ч. с целью получения биологически активных пептидов в них.

пептидыLactobacillusT-RFLPодномерный электрофорездвумерный электрофорезпротеомикаконинамясные продуктыpeptidesLactobacillusT-RFLPone-dimensional electrophoresistwo-dimensional electrophoresisproteomicshorsemeatmeat productsReferencesHood, L., Flores, M. (2012). A personal view on systems medicine and the emergence of proactive P4 medicine: predictive, preventive, personalized and participatory. New Biotechnology, 29 (6), 613–624.Hood, L., Flores, M. (2012). A personal view on systems medicine and the emergence of proactive P4 medicine: predictive, preventive, personalized and participatory. New Biotechnology, 29 (6), 613–624.Тутельян, В.А., Самсонов, М.А., Каганов, Б.С., Батурин, А.К., Шарафетдинов, Х.Х., Плотникова, О.А., Павлючкова, М.С. (2008).Картотека блюд диетического (лечебного и профилактического) питания оптимизированного состава. Практическое руководство. М, Национальная ассоциация клинического питания.—448 с. ISBN978–5–85597–105–7Tutel’yan, V.А., Samsonov, М.А., Kaganov, B.S., Baturin, А.К., Sarafetdinov, H.H., Plotnikova, О.А., Pavluchkova, М.S. (2008). Card catalogue of dishes of dietary (curative and prophylactic) nutrition of the optimized composition. Practical guideline. М.: National association of clinical nutrition.— 448 p. ISBN 978–5–85597–105–7. (in Russian).Тутельян, В.А., Вялков, А.Н., Разумов, В.И., Москаленко, К.А., Одинец, А.Г., Сбежнева, В.Г., Сергеев, В.Н. (2010). Научные основы здорового питания. М, Панорама.—839 с. ISBN978–5–86472–224–4.Tutel’yan V.А., Vyalkov A.I., Razumov A.N., Mikhailov V.I., Moskalenko K.A., Odinets A.G., Sbehzneva V.G., Sergeev V.N. (2010). Scientific foundations of healthy nutrition. М, Panorama. — 839 p. ISBN 978–5–86472–224–4. (in Russian).Arihara, K. (2006). Strategies for designing novel functional meat products. Meat Science, 74, 219–229.Arihara, K. (2006). Strategies for designing novel functional meat products. Meat Science, 74, 219–229.Shishkin, S.S., Kovalev, L.I., Kovaleva, M.A., Ivanov, A.V., Eremina, L.S., Sadykhov, E.G. (2014).The application of proteomic technologies for the analysis of muscle proteins of farm animals used in the meat industry (Review). Applied Biochemistry and Microbiology, 50, 453–465.Shishkin, S.S., Kovalev, L.I., Kovaleva, M.A., Ivanov, A.V., Eremina, L.S., Sadykhov, E.G. (2014).The application of proteomic technologies for the analysis of muscle proteins of farm animals used in the meat industry (Review). Applied Biochemistry and Microbiology, 50, 453–465.Olmedilla-Alonso, B., Jimenez-Colmenero, F., Sanchez-Muniz, F.J. (2013). Development and assessment of healthy properties of meat and meat products designed as functional foods. Meat Science, 95, 919–930.Olmedilla-Alonso, B., Jimenez-Colmenero, F., Sanchez-Muniz, F.J. (2013). Development and assessment of healthy properties of meat and meat products designed as functional foods. Meat Science, 95, 919–930.Te Pas, M.F.W, Kruijt, L., Pierzchala, M., Crump, R.E., Boeren, S., Keuning, E., Hoving-Bolink, R., Hortos, M., Gispert, M., Arnau, J., Diestre, A., Mulder, H.A. (2013). Identification of proteomic biomarkers in M. Longissimusdorsi as potential predictors of pork quality. Meat Science, 95, 679–687.Te Pas, M.F.W, Kruijt, L., Pierzchala, M., Crump, R.E., Boeren, S., Keuning, E., Hoving-Bolink, R., Hortos, M., Gispert, M., Arnau, J., Diestre, A., Mulder, H.A. (2013). Identification of proteomic biomarkers in M. Longissimusdorsi as potential predictors of pork quality. Meat Science, 95, 679–687.Yu, T. — Y., Morton, J.D., Clerens, S., Dyer, J.M. (2015). Proteomic Investigation of Protein Profile Changes and Amino Acid Residue Level Modification in Cooked Lamb Meat: The Effect of Boiling. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 63(41), 9112–9123.Yu, T. — Y., Morton, J.D., Clerens, S., Dyer, J.M. (2015). Proteomic Investigation of Protein Profile Changes and Amino Acid Residue Level Modification in Cooked Lamb Meat: The Effect of Boiling. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 63(41), 9112–9123.Chalamaiah, M., Jyothirmayi, T., Diwan, P.V., Dinesh Kumar, B. (2015). Antiproliferative, ACE-inhibitory and functional properties of protein hydrolysates from rohu (Labeorohita) roe (egg) prepared by gastrointestinal proteases. Journal of Food Science and Technology, 52 (12), 8300–8307.Chalamaiah, M., Jyothirmayi, T., Diwan, P.V., Dinesh Kumar, B. (2015). Antiproliferative, ACE-inhibitory and functional properties of protein hydrolysates from rohu (Labeorohita) roe (egg) prepared by gastrointestinal proteases. Journal of Food Science and Technology, 2015, 52 (12), 8300–8307.Meinert, L., Broge, E.H.D.L., Bejerholm, C., Jensen, K. (2016). Application of hydrolyzed proteins of animal origin in processed meat. Food Science and Nutrition, 4(2), 290–297.Meinert, L., Broge, E.H.D.L., Bejerholm, C., Jensen, K. (2016). Application of hydrolyzed proteins of animal origin in processed meat. Food Science and Nutrition, 4(2), 290–297.Lafarga, T., Rai, D. K., O’Connor, P., Hayes, M. (2015). A bovine fibrinogen-enriched fraction as a source of peptides with in vitro renin and angiotensin-i-converting enzyme inhibitory activities. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 63, 8676–8684.Lafarga, T., Rai, D. K., O’Connor, P., Hayes, M. (2015). A bovine fibrinogen-enriched fraction as a source of peptides with in vitro renin and angiotensin-i-converting enzyme inhibitory activities. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 63, 8676–8684.Minkiewicz, P., Dziuba, J., Michalska, J. (2011). Bovine meat proteins as potential precursors of biologically active peptides — a computational study based on the BIOPEP database. Food Science and Technology International, 17, 39–45.Minkiewicz, P., Dziuba, J., Michalska, J. (2011). Bovine meat proteins as potential precursors of biologically active peptides — a computational study based on the BIOPEP database. Food Science and Technology International, 17, 39–45.Gobbetti, M., Minervini, F., Rizzello, C.G. (2004). Angiotensin Iconverting-enzyme-inhibitory and antimicrobial bioactive peptides. International Journal of Dairy Technology, 57, 172–188.Gobbetti, M., Minervini, F., Rizzello, C.G. (2004). Angiotensin I-converting-enzyme-inhibitory and antimicrobial bioactive peptides. International Journal of Dairy Technology, 57, 172–188.Korhonen, H., Pihlanto, A. (2003). Food-derived bioactive peptides — Opportunities for designing future foods. Current Pharmaceutical Design, 9, 1297–1308.Korhonen, H., Pihlanto, A. (2003). Food-derived bioactive peptides — Opportunities for designing future foods. Current Pharmaceutical Design, 9, 1297–1308.Christensen, J.E., Dudley, E.G., Pederson, J.A., Steele, J.L. (1999). Peptidases and amino acid catabolism in lactic acid bacteria. Antonie van Leeuwenhoek, International Journal of General and Molecular Microbiology, 76, 217–246.Christensen, J.E., Dudley, E.G., Pederson, J.A., Steele, J.L. (1999). Peptidases and amino acid catabolism in lactic acid bacteria. Antonie van Leeuwenhoek, International Journal of General and Molecular Microbiology, 76, 217–246.Doeven, M. K., Kok, J., Poolman, B. (2005). Specificity and selectivity determinants of peptide transport in Lactococcuslactis and other microorganisms. Molecular Microbiology, 57, 640–649.Doeven, M. K., Kok, J., Poolman, B. (2005). Specificity and selectivity determinants of peptide transport in Lactococcuslactis and other microorganisms. Molecular Microbiology, 57, 640–649.Klaenhammer, T. R., Barrangou, R., Buck, B.L., AzcaratePeril, M. A., Altermann, E. (2005). Genomic features of lactic acid bacteria effecting bioprocessing and health. FEMS Microbiology Reviews, 29, 393–409.Klaenhammer, T. R., Barrangou, R., Buck, B.L., Azcarate-Peril, M. A., Altermann, E. (2005). Genomic features of lactic acid bacteria effecting bioprocessing and health. FEMS Microbiology Reviews, 29, 393–409.Savijoki K., Ingmer H., Varmanen P. (2006). Proteolytic systems of lactic acid bacteria. Applied Microbiology and Biotechnology, 71, 394–406.Savijoki K., Ingmer H., Varmanen P. (2006). Proteolytic systems of lactic acid bacteria. Applied Microbiology and Biotechnology, 71, 394–406.Hébert, E. M., Mamone, G., Picariello, G., Raya, R. R., Savoy, G., Ferranti, P., Addeo, F. (2008). Characterization of the pattern of αs1-and β-casein breakdown and release of a bioactive peptide by a cell envelope proteinase from Lactobacillus delbrueckii subsp. lactisCRL 581. Applied and Environmental Microbiology, 74 (12), 3682–3689.Hébert, E. M., Mamone, G., Picariello, G., Raya, R. R., Savoy, G., Ferranti, P., Addeo, F. (2008). Characterization of the pattern of αs1- and β-casein breakdown and release of a bioactive peptide by a cell envelope proteinase from Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis CRL 581. Applied and Environmental Microbiology, 74 (12), 3682–3689.Hébert, E. M., Raya, R. R., de Giori G. S. (1999). Characterisa- tion of a cell-envelope proteinase from Lactobacillus helveticus. Biotechnology Letters, 21(9), 831–834.Hébert, E. M., Raya, R. R., de Giori G. S. (1999). Characterisation of a cell-envelope proteinase from Lactobacillus helveticus. Biotechnology Letters, 21(9), 831–834.Hartmann, R., Meisel, H. (2007). Food-derived peptides with biological activity: from research to food applications. Current Opinion in Biotechnology, 18, 163–169.Hartmann, R., Meisel, H. (2007). Food-derived peptides with biological activity: from research to food applications. Current Opinion in Biotechnology, 18, 163–169.Singh, V. P., Pathak, V., Verma, A. K. (2012). Fermented meat products: organoleptic qualities and biogenic amines–A review. American Journal of Food Technology, 7, 278–288.Singh, V. P., Pathak, V., Verma, A. K. (2012). Fermented meat products: organoleptic qualities and biogenic amines–A review. American Journal of Food Technology, 7, 278–288.Гааль, Э., Медбеши, Г., Верецкеи, Л. (1982). Электрофорез в разделении биологических макромолекул. (Перевод с английского канд. биол. наук Е. Б. Майзеля, канд. биол. наук М. С. Морозовой и канд. биол. наук С. Н. Хилько, под редакцией проф. В. И. Розенгарта). М, Мир. — 448 с.Gaal, O., Medgyesi, G.A., Vereczkey, L. (1980). Electrophoresis in the Separation of Biological Macromolecules. Budapest, Akademiai Kiado.Ковалев, Л.И., Шишкин, С.С., Ковалева, М.А., Иванов, В.В., Вострикова, Н.Л., Чернуха, И.М. (2013). Протеомное изучение белков в образцах свинины и выработанных из нее мясных продуктах. Все о мясе, 3, 32–34.Kovalyov, L.I., Shishkin, S.S., Kovalyova, M.A., Ivanov, A.V., Vostrikova, N.L., Chernukha, I.M. (2013). Proteomic research proteins in a sample of pork meat products. Vsyo o myase, 3, 32–34. (in Russian).Kovalyov, L. I., Kovalyova, M. A., Kovalyov, P. L., Serebryakova, M. V., Moshkovskii, S. A., Shishkin, S.S. (2006). Polymorphism of Δ3,5-Δ2,4-dienoyl-coenzyme a isomerase (the ECH1 gene product protein) in human striated muscle tissue. Biochemistry (Moscow), 71(4), 448–453.Kovalyov, L. I., Kovalyova, M. A., Kovalyov, P. L., Serebryakova, M. V., Moshkovskii, S. A., Shishkin, S.S. (2006). Polymorphism of Δ3,5-Δ2,4-dienoyl-coenzyme a isomerase (the ECH1 gene product protein) in human striated muscle tissue. Biochemistry (Moscow), 71(4), 448–453.Zvereva, E.A., Kovalev, L.I., Ivanov, A.V., Kovaleva, M.A., Zherdev, A.V., Shishkin, S.S., Lisitsyn, A.B., Chernukha, I.M., Dzantiev, B.B. (2015). Enzyme immunoassay and proteomic characterization of troponin I as a marker of mammalian muscle compounds in raw meat and some meat products. Meat Science, 105(1), 46–52.Zvereva, E.A., Kovalev, L.I., Ivanov, A.V., Kovaleva, M.A., Zherdev, A.V., Shishkin, S.S., Lisitsyn, A.B., Chernukha, I.M., Dzantiev, B.B. (2015). Enzyme immunoassay and proteomic characterization of troponin I as a marker of mammalian muscle compounds in raw meat and some meat products. Meat Science, 105 (1), 46–52.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.