доктор технических наук, профессор, и. о. ректора «Кемеровского государственного университета», заведующий кафедрой «Бионанотехнология»,
Dr. Sci. (Eng.), Professor
кандидат технических наук, доцент, доцент кафедры «Бионанотехнология»
Ph.D., Associate Professor
Highly sensitive and specific method for identification of pathogenic prion protein was developed. It was found that the water-soluble fractions of beef proteins and plasma proteins of farm animals are normal prion proteins in cattle. Aligning gene sequences of pathogenic and normal prion protein of sheep (Ovis aries) revealed that the nucleotide sequences of PrPc and PrPsc are identical. Murine monoclonal antibody 15B3 was selected. Synthetic sequence of 194 bps was randomly produced (DNA-tail). The produced sequence and the database sequences have no homologues. Two primer of20 bps were selected for synthesized DNA-tail. The experimental data indicate that by using AGTCAGTCCTTGGCCTCCTT (left) and CAGTTTCGATCCTCCTCCAG (right) primers the amplification should be performed as follows: pre-denaturation, 95 °C, 60 seconds, 1 cycle; denaturation, 95 °C, 30 seconds, 30 cycles; annealing, 56 °C, 60 seconds, 30 cycles; elongation, 72 °C, 30 seconds, 30 cycles, additional elongation, 1 cycle, 600 seconds. The optimum concentration of reaction mixture components for PCR was established. High specificity of the developed test system and oligonucleotide primers was confirmed by electrophoretic separation of ground beef samples containing pathogenic prion protein, as well as by comparative analysis of the results of pathogenic prion protein determination. These results were obtained using PCR test system and TeSeE™ ELISA system.
Разработан высокочувствительный и специфичный метод идентификации патогенного прионного белка. Установлено, что фракции водорастворимых белков говядины и плазмы крови сельскохозяйственных животных являются нормальными прионными белками крупного рогатого скота. Выравнивание последовательностей гена патогенного и нормального прионного белка Ovisaries, показало, что нуклеотидные последовательности PrPc и PrPsc являются идентичными. Выбрано мышиное моноклональное антитело 15В3. Построена синтетическая последовательность, дли-ной 194 п.н., полученная случайным образом (ДНК-хвост). Созданная последовательность и последовательности базы данных гомологов не имеют. К синтезированному ДНК-хвосту подобраны 2 праймера размерами 20 п.н. Полученныеэкспериментальные данные указывают на то, что при использовании праймеров AGTCAGTCCTTGGCCTCCTT (левого) и CAGTTTCGATCCTCCTCCAG (правого) амплификацию следует проводить по следующей схеме: предварительная денатурация, 95 °С, 60 секунд, 1 цикл; денатурация, 95 °С, 30 секунд, 30 циклов; отжиг, 56 °С, 60 секунд, 30 циклов; элонгация, 72 °С, 30 секунд, 30 циклов, дополнительная элонгация в течение 1 цикла продолжительностью 600 секунд.Установлена оптимальная концентрация компонентов реакционной смеси для проведения ПЦР. Подтверждена высокая специфичность разработанной тест-системы и олигонуклеотидных праймеров путем электрофоретического разделения образцов мясного фарша, содержащего патогенный прионный белок, а также путем сравнительного анализа результатов определения патогенного прионного белка,полученных с помощью ПЦР-тест-системы и ИФА-системы «TeSeE™».
The authors declare that there are no conflicts of interest present.